Fragmenty przeciwciał w terapii. Fragment Fab przeciwciała. Kompletne przeciwciała. Niekompletne przeciwciała. Fragment Fc przeciwciała Podręczniki, wykłady wideo, protokoły

Przeciwciała (Ab) są cząsteczkami efektorowymi odporności humoralnej. Synteza przeciwciał jest wyzwalana przez Ags dostające się do organizmu z zewnątrz (podczas infekcji, szczepień, narażenia na ksenobiotyki) lub powstaje endogennie. Z reguły AT specyficznie oddziałuje z komplementarnym Ag. Istnieją jednak przeciwciała, które oddziałują z determinantami Ag wspólnymi dla różnych Ag. Takie przeciwciała są znane jako reagujące krzyżowo lub heterospecyficzne.

Przeciwciała występują w milionach odmian, a każda cząsteczka ma unikalne miejsce wiązania determinanty antygenu. W większości przypadków pojawiają się przeciwciała glikoproteiny surowicy, migrujące w ramach powolnej frakcji gamma globulin podczas elektroforezy białek surowicy. Dlatego też termin „gamma” jest czasami używany do określenia frakcji AT w surowicy. -globuliny».

Nazywane są również przeciwciałami immunoglobuliny”. Przeciwciała (Ab) tworzą jedną z głównych frakcji białek krwi, stanowiąc 20% masy całkowitego białka osocza. AT są odporne na działanie słabych kwasów i zasad oraz nagrzewanie do 60°C.

Jednostką strukturalną AT jest monomer – cylindryczna cząsteczka składająca się z dwóch identycznych ciężkich łańcuchów H [z ang. ciężki, ciężki] i dwa identyczne lekkie łańcuchy L [z ang. światło] Łańcuchy ciężkie i lekkie Ig składają się z reszt aminokwasowych i są połączone wiązaniami dwusiarczkowymi (-S-S-). W łańcuchach wyróżnia się region zmienny lub region V. różne, różne] i region stały lub region C [z angielskiego. stały, stały]. Region V różni się w zależności od terminala AT. Regiony V łańcuchów L i H tworzą centrum wiązania Ag (centrum aktywne AT, paratop) lub fragment Fab [z języka angielskiego. fragment fragmentu, + wiązanie antygenu, wiązanie Ag]. Region stały cząsteczki nazywany jest fragmentem Fc. fragment krystalizujący, fragment krystalizujący].

Na styku fragmentów Fab i Fc znajduje się region zawiasowy, który umożliwia rozwinięcie fragmentów wiążących Ag w celu bliższego kontaktu z Ag.

Region cząsteczki przeciwciała (Fab) determinuje specyficzność antygenu, a Fc pełni funkcje efektorowe.

Fragmenty Fab przeciwciał oddziałują z determinantami antygenowymi. Centrum wiązania Ag jest komplementarne do epitopu Ag (zasada blokady klucza). Wiązanie Ag z AT jest niekowalencyjne i odwracalne. Powinowactwo (powinowactwo) Ag do przeciwciała jest określone przez właściwości fizykochemiczne oddziałujących cząsteczek oraz stosunek stężeń związanego i wolnego Ag oraz przeciwciał. Na powinowactwo wpływa przestrzenna zgodność oddziałujących obszarów cząsteczek, oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe i siły van der Waalsa.

Chciwość- integralna charakterystyka siły wiązania pomiędzy Ag i AT, uwzględniająca oddziaływanie wszystkich centrów aktywnych z epitopami Ag.

Wartościowość przeciwciał- liczba aktywnych (wiążących Ag) centrów przeciwciał. Kompletna cząsteczka Ig jest co najmniej dwuwartościowa. Takie przeciwciała nazywane są przeciwciałami kompletnymi; monomery o niższej wartościowości są przeciwciałami niekompletnymi.

Kompletne przeciwciała(w szczególności IgM, IgG) powodują agregację Ag widoczną gołym okiem (na przykład RA bakterii).

Niekompletne przeciwciała zawierają jedno centrum wiązania Ag i dlatego są jednowartościowe (na przykład przeciwciała wytwarzane w brucelozie). Drugie centrum wiązania Ag w takich Ig jest osłonięte różnymi strukturami lub ma niską awidność.

Niekompletne przeciwciała są funkcjonalnie wadliwe, ponieważ nie są w stanie agregować Ag. Niekompletne AT mogą wiązać epitopy Ag, uniemożliwiając kontakt z nimi kompletnych przeciwciał; dlatego też się je nazywa blokujące przeciwciała.

Fragment Fc przeciwciała

Regiony stałe łańcuchów ciężkich determinują charakter oddziaływań przeciwciała z komórkami i cząsteczkami układu odpornościowego, w szczególności specyficzność wiązania cząsteczki Ig z komórkami efektorowymi (np. fagocytami, komórkami tucznymi) niosącymi receptory dla Fragment Fc na ich powierzchni.

Fragment Fc określa także funkcje efektorowe przeciwciała (na przykład aktywację dopełniacza). Aby zrealizować te właściwości, bezpośrednio po związaniu Ag przez fragmenty Fab zachodzą zmiany konformacyjne w strukturze fragmentów Fc. Przestrzennie zmienione fragmenty Fc są rozpoznawane przez fagocyty, przyczyniają się do wiązania składnika C1a dopełniacza i uruchomienia kaskady komplementarnej wzdłuż szlaku klasycznego. W przeciwnym razie ani komórki, ani cząsteczki efektorowe nie byłyby w stanie rozróżnić pomiędzy nienaruszonym AT a przeciwciałami, które związały Ag.

Interakcja przeciwciał z antygenem obejmuje fazy specyficzne i niespecyficzne.

Specyficzna faza przebiega szybko i reprezentuje specyficzną interakcję centrum aktywnego z Ag.

Faza niespecyficzna przebiega wolniej i zależy od obecności elektrolitów oraz właściwości Ag. Ags korpuskularne agregują w gruboziarniste konglomeraty i wytrącają się (zjawisko aglutynacji).

Rozpuszczalne Ags tworzą drobno zdyspergowane konglomeraty (zjawisko strącania), objawiające się zmętnieniem roztworu lub utworzeniem pierścieni strącających lub stref strącania w żelach.

Istnieją dwa typy regionów stałych łańcucha lekkiego – kappa (k) i lambda; Stałe losy łańcuchów ciężkich reprezentowane są przez pięć głównych form - mu (p), gamma (y), delta (8), alfa (a) i epsilon (e). Każdy z nich jest powiązany z odrębną klasą Ig. Istnieje 5 klas AT: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM.

Cząsteczki IgG, IgD i IgE są reprezentowane przez monomery, IgM - pentamery; Cząsteczki IgA w surowicy krwi są monomerami, a w wydalanych płynach (płynie łzowym, ślinie, wydzielinie błon śluzowych) są dimerami.

IgM są syntetyzowane po początkowym wejściu Ag do organizmu. Szczyt powstawania występuje w 4-5 dniu, po czym następuje spadek miana. Tworzenie się IgM wobec niektórych Ag (na przykład wiciowych Ag bakterii) zachodzi w sposób ciągły. IgM obejmuje znaczną część AT wytwarzaną przez Ag bakterii Gram-ujemnych.

Obecność IgM wobec Ag określonego patogenu wskazuje na ostry proces zakaźny.

Cząsteczka IgM jest pentamerem; pięć podjednostek jest połączonych łańcuchem J [z angielskiego. łączenie, wiązanie], w wyniku czego cząsteczka IgM nabywa 10 miejsc wiązania Ag.

Cząsteczki IgM opsonizują, aglutynują, wytrącają i lizują struktury zawierające Ag, a także aktywują układ dopełniacza na drodze klasycznej (jedna cząsteczka IgM wystarcza do lizy bakterii zależnej od dopełniacza).

Immunoglobulina G (IgG)- główna klasa AT (aż 75% wszystkich Ig), chroniąca organizm przed bakteriami, wirusami i toksynami. Po pierwszym kontakcie z Ag synteza IgM jest zwykle zastępowana przez tworzenie IgG.

Maksymalne miano IgG podczas pierwotnej odpowiedzi obserwuje się w dniach 6-8. Wykrycie wysokich mian IgG wobec Ag konkretnego patogenu wskazuje, że organizm znajduje się w fazie rekonwalescencji lub niedawno przebył daną chorobę. Szczególnie duże ilości IgG są syntetyzowane podczas odpowiedzi wtórnej.

IgG jest reprezentowana przez 4 podklasy: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4; ich względna zawartość (w%) wynosi odpowiednio 66-70, 23, 7-8 i 2-4. IgG bezpośrednio uczestniczy w reakcjach cytolizy immunologicznej, reakcjach neutralizacji, a także wzmaga fagocytozę, pełniąc funkcję opsonin i wiążąc receptory fragmentów Fc w błonie komórek fagocytarnych (dzięki temu fagocyty skuteczniej absorbują i lizują mikroorganizmy).

Tylko IgG jest w stanie przeniknąć przez łożysko, co zapewnia powstanie odporności biernej u płodu.

Immunoglobulina A (IgA) krążą w surowicy krwi (stanowi 15-20% wszystkich Ig), a także są wydzielane na powierzchnię nabłonka. Obecny w ślinie, płynie łzowym, mleku i na powierzchni błon śluzowych.

AT klasy IgA wzmacniają właściwości ochronne błon śluzowych przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, narządów płciowych i dróg moczowych. W surowicy krwi IgA krąży w postaci dwuwartościowych monomerów; w wydzielanych płynach dominują dimery czterowartościowe, zawierające jeden łańcuch J i dodatkową cząsteczkę polipeptydu (składnik wydzielniczy syntetyzowany przez komórki nabłonkowe).

Cząsteczka ta przyłącza się do monomerów IgA podczas ich transportu przez komórki nabłonkowe na powierzchnię błon śluzowych. Składnik wydzielniczy bierze udział nie tylko w wiązaniu cząsteczek IgA, ale zapewnia ich wewnątrzkomórkowy transport i uwalnianie na powierzchnię błon śluzowych, a także chroni IgA przed trawieniem przez enzymy proteolityczne.

Cząsteczki IgA biorą udział w reakcjach neutralizacji i aglutynacji patogenów. Dodatkowo po utworzeniu kompleksu Ag-AT uczestniczą w aktywacji dopełniacza drogą alternatywną.

Immunoglobulina E (IgE) specyficznie oddziałują z komórkami tucznymi i bazofilnymi leukocytami zawierającymi liczne granulki z substancjami biologicznie czynnymi. Ich uwolnienie z komórki (degranulacja) powoduje gwałtowne rozszerzenie światła żyłek i wzrost przepuszczalności ich ścian. Podobny obraz można zaobserwować w przypadku reakcji alergicznych (na przykład astmy oskrzelowej, alergicznego nieżytu nosa, pokrzywki).

Wiążące Ag fragmenty Fab cząsteczki IgE specyficznie oddziałują z Ag, który dostaje się do organizmu. Powstały kompleks immunologiczny oddziałuje z receptorami fragmentów Fc IgE osadzonych w błonie komórkowej bazofila lub komórki tucznej. Ta interakcja jest sygnałem do degranulacji z uwolnieniem histaminy i innych substancji biologicznie czynnych i rozwojem ostrej reakcji alergicznej.

Fragmenty Fab przeciwciał oddziałują z determinantami antygenowymi. Centrum wiązania Ag jest komplementarne do epitopu Ag (zasada blokady klucza). Wiązanie Ag z AT jest niekowalencyjne i odwracalne. Powinowactwo (powinowactwo) Ag do przeciwciał określane na podstawie właściwości fizykochemicznych oddziałujących cząsteczek oraz stosunku stężeń związanego i wolnego Ag i przeciwciała. Na powinowactwo wpływa przestrzenna zgodność oddziałujących obszarów cząsteczek, oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe i siły van der Waalsa.

Chciwość- integralna charakterystyka siły wiązania pomiędzy Ag i AT, uwzględniająca oddziaływanie wszystkich centrów aktywnych z epitopami Ag.

Wartościowość przeciwciał- liczba aktywnych centrów (wiążących Ag). przeciwciała. Kompletna cząsteczka Ig jest co najmniej dwuwartościowa. Taki przeciwciała znany jako kompletne przeciwciała; monomery o niższej wartościowości - niekompletne przeciwciała.

Kompletne przeciwciała(w szczególności IgM, IgG) powodują agregację Ag widoczną gołym okiem (na przykład RA bakterii).

Niekompletne przeciwciała zawierają jedno centrum wiązania Ag i dlatego są jednowartościowe (np. przeciwciała, powstający w brucelozie). Drugie centrum wiązania Ag w takich Ig jest osłonięte różnymi strukturami lub ma niską awidność.

Niekompletne przeciwciała funkcjonalnie wadliwe, ponieważ nie są w stanie agregować Ag. Niekompletna AT może wiązać epitopy Ag, uniemożliwiając kontakt z nimi pełne przeciwciała; dlatego też się je nazywa blokujące przeciwciała.

Fragment Fc przeciwciała

Stałe regiony łańcuchów ciężkich determinują charakter oddziaływań przeciwciała z komórkami i cząsteczkami układu odpornościowego, w szczególności specyfiką wiązania cząsteczki Ig z komórkami efektorowymi (np. fagocytami, komórkami tucznymi), które niosą na swojej powierzchni receptory dla fragmentu Fc.

fragment FC określa również efektor funkcje przeciwciał(na przykład aktywacja dopełniacza). Aby zrealizować te właściwości, bezpośrednio po związaniu Ag przez fragmenty Fab zachodzą zmiany konformacyjne w strukturze fragmentów Fc. Przestrzennie zmienione fragmenty Fc są rozpoznawane przez fagocyty, przyczyniają się do wiązania składnika C1a dopełniacza i uruchomienia kaskady komplementarnej wzdłuż szlaku klasycznego. W przeciwnym razie ani komórki, ani cząsteczki efektorowe nie byłyby w stanie rozróżnić pomiędzy nienaruszonym AT lub przeciwciała, powiązany Ag.

1. Temat wykładu:„Układ odporności humoralnej. Różnicowanie limfocytów B. Struktura immunoglobuliny G”

2. Cel: Aby zapoznać uczniów z głównymi funkcjami układu odpornościowego B, rozważ główne etapy różnicowania limfocytów B, strukturę i funkcje immunoglobuliny G.

3. Streszczenia wykładów:

Podstawowe funkcje systemu B.

Struktura chemiczna immunoglobuliny G.

Funkcje fragmentów Fab i Fc immunoglobulin

Humoralny układ odpornościowy to wyspecjalizowany system, którego główną funkcją jest synteza przeciwciał przeciwko antygenom. Aktywność funkcjonalna humoralnego układu odpornościowego w większości przypadków zależy od ścisłej interakcji z układem odporności T i komórkami prezentującymi antygen.

Głównymi komórkami humoralnego układu odpornościowego są limfocyty B, odpowiedzialne za syntezę przeciwciał. Udział przeciwciał w realizacji humoralnej odpowiedzi immunologicznej związany jest z tworzeniem kompleksów immunologicznych z antygenami rozpuszczalnymi i korpuskularnymi. W ramach kompleksów immunologicznych antygeny są izolowane i/lub niszczone.

Główną funkcją przeciwciał jest specyficzne wiązanie antygenu. Specyficzna interakcja antygenów i przeciwciał opiera się na istniejącej między nimi zgodności przestrzennej, czyli komplementarności.

Cząsteczka IgG zawiera 4 łańcuchy polipeptydowe: 2 ciężkie i 2 lekkie. Aminokwasy tzw. regionu hiperzmiennego domen V wchodzą w bezpośredni kontakt z antygenem. Wnęka centrum aktywnego znajduje się pomiędzy obszarami zmiennymi łańcucha ciężkiego i lekkiego i dokładnie odpowiada kształtem określonej grupie haptenów. Fragment zawierający domeny stałe obu łańcuchów ciężkich (2CH2 i 2CH3) nazywany jest fragmentem Fc.

Główne funkcje fragmentów Fab i Fc

Główną funkcją fragmentu Fab jest wiązanie antygenu , ponieważ zawiera aktywne centrum wiążące antygen cząsteczki immunoglobuliny, utworzone przez domeny VH i VL łańcuchów ciężkich i lekkich.

Funkcje fragmentu Fc:

1. Różne klasy immunoglobulin różnią się budową fragmentów Fc. Różnice te mogą dotyczyć zarówno liczby domen CH zawartych we fragmentach Fc, jak i ich składu aminokwasowego (mogą występować dodatkowe domeny, np. CH4 w IgM i IgE). Ze względu na różnice w budowie fragmentów Fc, klasy immunoglobulin różnią się także funkcją.

2. Za pomocą fragmentów Fc następuje polimeryzacja cząsteczek immunoglobulin. Na przykład wydzielnicza IgA tworzy dimery i trimery, a IgM w surowicy jest pentamerem.

3. We fragmentach Fc IgM, IgG 1 i IgG 3 po związaniu się z antygenem następuje zmiana strukturalna, w wyniku której w rejonie domeny CH2, która wiąże się z pierwszym składnikiem układu dopełniacza, pojawia się miejsce aktywne, zatem te klasy immunoglobulin u ludzi powodują aktywację układu dopełniacza drogą klasyczną.

4. Za pomocą fragmentów Fc cząsteczki immunoglobulin integrują się z błoną plazmatyczną limfocytów B i są receptorami rozpoznającymi antygen.

5. Na powierzchni wielu komórek organizmu znajdują się Receptory Fc dla różnych klas immunoglobulin. Jeśli do tych receptorów zostaną przyłączone odpowiednie immunoglobuliny lub kompleksy immunologiczne zawierające te immunoglobuliny, wówczas poprzez te receptory może nastąpić aktywacja lub supresja funkcji odpowiednich komórek .

4. Materiał ilustracyjny: wykład multimedialny nr 2

wspaniały fragment (łac. fragmentum fragment, kawałek)

część cząsteczki immunoglobuliny przecięta papainą i składająca się z łańcucha lekkiego i końca aminowego połowy łańcucha ciężkiego; niesie ze sobą antydeterminantę.

1. Mała encyklopedia medyczna. - M.: Encyklopedia medyczna. 1991-96 2. Pierwsza pomoc. - M.: Wielka encyklopedia rosyjska. 1994 3. Encyklopedyczny słownik terminów medycznych. - M .: Encyklopedia radziecka. - 1982-1984.

Zobacz, czym jest „fragment Fab” w innych słownikach:

- ... Wikipedii

Ten artykuł jest o immunologii. Informacje o ukraińskiej grupie poprockowej można znaleźć w artykule Przeciwciała (grupa) . o filmie zobacz Przeciwciała (film, 2005). Przeciwciała (immunoglobuliny, IG, Ig) to specjalna klasa glikoprotein obecna w ... ... Wikipedia

- (Ig), grupa pokrewnych chemicznie. charakter i właściwości białek globularnych kręgowców i ludzi, które zwykle posiadają przeciwciała, tj. specyficzne. zdolność wiązania się z antygenem, co stymuluje ich powstawanie. I. produkowane są w... ... Encyklopedia chemiczna

I Przeciwciała to białka w surowicy krwi i innych płynach biologicznych, które są syntetyzowane w odpowiedzi na wprowadzenie antygenu i mają zdolność specyficznego oddziaływania z antygenem, który spowodował ich powstanie, lub z izolowaną determinantą. Encyklopedia medyczna

Białka z grupy immunoglobulin, powstające w organizmie człowieka i zwierząt stałocieplnych w odpowiedzi na wnikanie substancji (antygenów) i neutralizowanie ich szkodliwego działania. Głównymi formami przejawów aktywności A. są aglutynacja, wytrącanie,... ... Słownik mikrobiologii

Substancja czynna ›› Abciximab* (Abciximab*) Nazwa łacińska ReoPro ATX: ›› B01AC13 Abciximab Grupa farmakologiczna: Leki przeciwpłytkowe Klasyfikacja nosologiczna (ICD 10) ›› I20 Dławica piersiowa [dławica piersiowa] ›› I20.0 Niestabilny… … Słownik leków

DUSZA- [Grecki ψυχή] wraz z ciałem tworzy kompozycję osoby (patrz artykuły Dychotomizm, Antropologia), będąc jednocześnie niezależną zasadą; W obrazie człowieka zawarty jest obraz Boga (według niektórych Ojców Kościoła; według innych obraz Boga zawarty jest we wszystkim... ... Encyklopedia ortodoksyjna

- (Apollo, Απόλλων). Bóstwo słońca, syn Zeusa i Leto (Latona), brat bliźniak bogini Artemidy. Apollo był także uważany za boga muzyki i sztuki, boga wróżbiarstwa oraz patrona stad i bydła. Bierze czynny udział w zakładaniu miast i władz... Encyklopedia mitologii

DIONIZJUSZ WIELKI- [Grecki Διονύσιος ὁ Μέγας] (koniec II w. 264/5), św., hiszpański. (wspomnienie 5 października, wspomnienie greckie 3 października), biskup. Aleksandryjczyk, teolog, kościelna osoba publiczna. Życie Głównym źródłem biografii D.V. są pisma Euzebiusza z Cezarei... ... Encyklopedia ortodoksyjna

- (Actaeon, Άχταίων). Słynny myśliwy, syn Aristaeusa i Autoni. Pewnego razu podczas polowania zobaczył kąpiącą się Artemidę i jej nimfy, za co bogini zamieniła go w jelenia i został rozszarpany na kawałki przez swoje 50 psów. Według innej legendy Artemida zamieniła go w jelenia na... ... Encyklopedia mitologii

- (Άθηνά), w mitologii greckiej bogini mądrości i sprawiedliwej wojny. Przedgreckie pochodzenie wizerunku A. nie pozwala na ujawnienie etymologii imienia bogini, opartej wyłącznie na języku greckim. Mit o narodzinach A. od Zeusa i Metis („mądrość”, ... ... Encyklopedia mitologii

UKD 577.322.24

DO Dormeshkin, student studiów magisterskich (BSTU);

V. N. Leontiev, kandydat nauk chemicznych, profesor nadzwyczajny, kierownik katedry (BSTU);

I. G. Iwaszkiewicz, kandydat nauk chemicznych (IBOC NAS z Białorusi);

A. A. Gilep, kandydat nauk chemicznych, kierownik laboratorium (IBOC NAS z Białorusi)

UZYSKANIE REKOMBINOWANYCH FRAGMENTÓW FAB PRZECIWCIAŁ SWOICH DLA KORTIZOLU

W pracy przeprowadzono molekularne klonowanie genów kodujących strukturę mysich immunoglobulin, które specyficznie wiążą hormon steroidowy kortyzol. W tym celu zaprojektowano startery obejmujące całą rodzinę genów kodujących strukturę immunoglobulin klasy G. Stworzono molekularne konstrukty genetyczne umożliwiające efektywną ekspresję rekombinowanych przeciwciał w komórkach Escherichia coli. Przeprowadzono heterologiczną ekspresję fragmentów Fab przeciwciał. Rekombinowane białko otrzymuje się w stanie jednorodnym.

W artykule skupiono się na molekularnym klonowaniu genów kodujących strukturę mysich immunoglobulin, które mogą specyficznie wiązać hormon steroidowy kortyzol. W tym celu skonstruowano startery, obejmujące wszystkie rodziny genów kodujących strukturę immunoglobulin G oraz konstrukcje molekularno-genetyczne umożliwiające efektywną ekspresję rekombinowanych przeciwciał w Escherichia coli. Przeprowadzono heterologiczną ekspresję fragmentów Fab. Rekombinowane białko wyizolowano w stanie jednorodnym.

Wstęp. Kortyzol (ryc. 1) jest jednym z najważniejszych hormonów steroidowych i jest niezbędny do utrzymania wielu funkcji organizmu. Podobnie jak inne glikokortykosteroidy, kortyzol jest syntetyzowany w strefie pęczkowej kory nadnerczy ze zwykłego cholesterolu prekursorowego. Pomiar poziomu hormonu steroidowego kortyzolu we krwi ma ogromne znaczenie w monitorowaniu funkcji przysadki mózgowej i kory nadnerczy. Obecnie istnieje duża różnorodność systemów diagnostycznych służących do ilościowego oznaczania kortyzolu w płynach biologicznych. Większość z nich w taki czy inny sposób wykorzystuje zasadę rozpoznawania kortyzolu przez powinowactwo przez odpowiednie przeciwciała (immunoglobuliny). Pilnym zadaniem jest poprawa właściwości funkcjonalnych modułu rozpoznającego systemów diagnostycznych, a także obniżenie ich kosztów. Jednym z możliwych sposobów rozwiązania tego problemu jest zastosowanie przeciwciał rekombinowanych, które mają szerszy zakres właściwości w porównaniu z przeciwciałami pełnej długości.

Ryż. 1. Wzór strukturalny kortyzolu

Immunoglobuliny to rodzina glikoprotein obecnych w osoczu krwi i

płyny tkankowe kręgowców, zdolne do rozpoznawania i wiązania substancji obcych dla organizmu (antygeny). Region antygenu, z którym oddziałuje przeciwciało, nazywany jest epitopem, a region przeciwciała, poprzez który oddziałuje ono z antygenem, nazywany jest paratopem.

U wyższych ssaków immunoglobuliny są reprezentowane przez pięć klas: IgO, IgM, IgA, IgE i IgB. Najbardziej interesująca z praktycznego punktu widzenia jest najpowszechniejsza klasa - ^O, która w organizmie człowieka jest reprezentowana przez cztery podklasy (izotypy): ^1, ^2, DOZ i ^4.

Immunoglobulina jest multimerycznym białkiem składającym się z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich i dwóch łańcuchów lekkich (ryc. 2).

Łańcuch ciężki Łańcuch lekki

Ryż. 2. Struktura cząsteczki immunoglobuliny

232 ISSN 1683-0377. Postępowanie BSTU. 2013. Nr 4. Chemia, technologia substancji organicznych i biotechnologia

Cząsteczkę immunoglobuliny można warunkowo podzielić na dwie podjednostki funkcjonalne - fragment Fab (wiązanie fragmentu z antygenem) i fragment Fc (fragment zdolny do krystalizacji). Fragment Fc składa się z dwóch par domen stałych (CH2 i CH3) i odpowiada za interakcję z receptorami komórkowymi podczas aktywacji odpowiedzi immunologicznej, a także z białkami układu dopełniacza. Fragment Fab bierze udział w rozpoznawaniu antygenu i składa się z jednego regionu zmiennego (VL ​​i VH) i jednego regionu stałego (CL i CH1). Poszczególne łańcuchy polipeptydowe są połączone ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi i oddziaływaniami niekowalencyjnymi. Dodatkowo na poziomie regionu CH2 cząsteczka ulega glikozylacji.

Wraz z rozwojem technologii genetyki molekularnej powszechne stały się miniprzeciwciała: fragmenty Fab- (fragment wiążący antygen) i scFv- (jednołańcuchowe fragmenty zmienne), które są zdolne do specyficznego wiązania antygenu, ale mają większą zdolność penetracji niż pełnowymiarowe przeciwciała. Fragment Fab jest białkiem o masie 50 kDa składającym się z regionu łańcucha ciężkiego (VH i CH1) i łańcucha lekkiego, połączonych ze sobą wiązaniami dwusiarczkowymi i oddziaływaniami niekowalencyjnymi. Fragment składający się wyłącznie z regionów zmiennych (VH i VL) połączonych łącznikiem peptydowym jest fragmentem scFv i ma masę cząsteczkową 15 kDa. Rekombinowane miniprzeciwciała można wytwarzać w bakteryjnym układzie ekspresyjnym, w przeciwieństwie do immunoglobulin pełnej długości, których domena Fc jest glikozylowana i dlatego wymaga systemów modyfikacji potranslacyjnych. Strukturą i odpowiednio właściwościami fizykochemicznymi fragmentów przeciwciał można łatwo manipulować na poziomie genów i można je przekształcić w przeciwciała pełnej długości w celu uzyskania funkcji efektorowych.

Głównym elementem. Głównym celem było uzyskanie fragmentów Fab o wysokim powinowactwie przeciwciał przeciwko hormonowi steroidowemu kortyzolowi.

Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez hybrydomy 5G-H2 (uzyskane w Pracowni Chemii Hormonów Białkowych Instytutu Chemii Bioorganicznej Narodowej Akademii Nauk Białorusi) są zdolne do swoistego wiązania się z hormonem steroidowym kortyzolem. Jednakże zastosowanie linii hybrydom wytwarzających przeciwciała monoklonalne ma szereg istotnych wad, do których zalicza się niestabilność linii komórkowych, wysoki koszt hodowli i niemożność przeprowadzenia manipulacji inżynierią genetyczną z genami immunoglobulin. Ponadto otrzymał

Wykorzystując technologię hybrydom, przeciwciała mogą zawierać domieszki mysich immunoglobulin, które zwiększają prawdopodobieństwo fałszywych wyników w przypadku stosowania w systemach diagnostycznych. Wszystkie te ograniczenia można pokonać stosując rekombinowane przeciwciała uzyskane metodami inżynierii genetycznej i wyrażane w układzie bakteryjnym.

Pierwszym krokiem była izolacja całkowitego RNA z hybrydom 5G-H2, które wytwarzają specyficzne przeciwciała przeciwko hormonowi steroidowemu kortyzolowi. Całkowity RNA wyizolowano przy użyciu zestawu SV Total RNA Isolation (Promega) i natychmiast wykorzystano do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji ze starterami oligo-IgT)18 w celu uzyskania cDNA (zestaw odczynników Reverta-L z Centralnego Instytutu Epidemiologii w Rospotrebnadzor użyto).

Powstały cDNA wykorzystano jako matrycę do amplifikacji genów kodujących struktury łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Na podstawie analizy danych literaturowych oraz sekwencji nukleotydowych immunoglobulin z bazy IMGT.org zaprojektowano specyficzne zdegenerowane startery obejmujące całą różnorodność genów cDNA kodujących lekkie i ciężkie łańcuchy mysich immunoglobulin klasy G. Amplifikację przeprowadzono we wzmacniaczu BioRad T100 w następujących warunkach: denaturacja 94°C przez 4 min; 30 cykli - denaturacja 94°C przez 1 min, wyżarzanie 55°C przez 1 min, elongacja 72°C przez 1 min. Końcowy etap wydłużania wynosi -72°C przez 10 minut.

Zamplifikowane fragmenty rozdzielono metodą elektroforezy żelowej w 2% żelu agarozowym, stosując bufor TAE w obecności bromku etydyny (wyniki rejestrowano przy użyciu systemu wideo Gel Imager 2 (Vilber Lourmat)). W każdym przypadku przeprowadzono dodatnią i ujemną kontrolę amplifikacji.

Po PCR produkty amplifikacji wklonowano do wektora pXcmkn12 i zsekwencjonowano w celu potwierdzenia prawidłowej sekwencji sklonowanego DNA (sekwencję nukleotydów określono przy użyciu zestawu ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycler Sequencing Kit, Big Dye X Terminator Purification Kit i sekwencer Applied Biosystems 3130). Sekwencjonowanie wykazało, że sklonowany łańcuch ciężki był typu G2a, co jest zgodne z izotypem przeciwciał wytwarzanych przez hybrydomę, a łańcuch lekki był typu k.

Do ekspresji fragmentów Fab przeciwciał stosuje się specjalnie zaprojektowane

wektor plazmidowy pCW-Fab, zapewniający wysoki poziom ekspresji rekombinowanych przeciwciał w przestrzeni peryplazmatycznej Escherichia coli.

Do preparatywnej ekspresji wykorzystano komórki E. coli DH5a transformowane wektorem bicistronowym pCW-Fab zawierającym sklonowane geny domeny Fab.

Hodowlę komórek E. coli DH5a prowadzono w pożywce TB. Indukcję hodowli komórkowej do syntezy białek przeprowadzono przy użyciu IPTG (izopropyl^^-1-tiogalaktopiranozyd), który wyzwala transkrypcję poprzez indukcję operonu laktozowego.

Komórki niszczono przy użyciu homogenizatora Emulsiflex-C5 z dodatkiem detergentu (CHAPS), inhibitora proteazy serynowej (PMSF) i β-merkaptoetanolu. Zniszczone komórki oddzielono przez wirowanie. Supernatant naniesiono na kolumnę chromatograficzną z ProteinA Sepharose. Białko A jest białkiem ulegającym ekspresji w komórkach Staphylococcus aureus i zdolnym do wiązania domeny CH1 ciężkiego łańcucha immunoglobulin, co pozwala na zastosowanie chromatografii powinowactwa do izolacji rekombinowanych fragmentów Fab (izolacja białka Bio-Rad „Bio-Logic” i zastosowano system oczyszczania).

Homogeniczność powstałego białka monitorowano za pomocą elektroforezy PAGE w warunkach denaturujących, która wykazała obecność dwóch łańcuchów polipeptydowych o oczekiwanej masie cząsteczkowej, co potwierdza skuteczność utworzonych konstruktów. Aktywność funkcjonalna rekombinowanych fragmentów Fab przeciwciał wymaga dalszych badań.

Wniosek. Przeprowadzono klonowanie molekularne genów kodujących strukturę mysich immunoglobulin specyficznych dla kortyzolu. Wyniki sekwencjonowania potwierdziły, że sklonowane fragmenty należą do klasy immunoglobulin. Stworzone molekularne konstrukty genetyczne umożliwiły przeprowadzenie heterologicznej ekspresji rekombinowanych fragmentów Fab w komórkach E. coli. Otrzymano rekombinowane białko w stanie jednorodnym o masie cząsteczkowej odpowiadającej oczekiwaniom. Właściwości powstałych fragmentów Fab przeciwciał wymagają dalszych badań.

Zespół autorów wyraża wdzięczność Laboratorium Chemii Hormonów Białkowych oraz osobiście Doktorowi Nauk Chemicznych O. V. Sviridovowi i Kandydatowi Nauk Chemicznych Ivashkevichowi I. G. za życzliwe udostępnienie linii komórkowych hybrydom 5G-H2.

Literatura

1. Spironelli, C. Poziomy kortyzolu i ACTH w osoczu u dzieciobójstw matek i agresywnych kobiet psychiatrycznych / C. Spironelli, F. J. Gradante // Psychiatr Res. - 2013. - Cz. 47. - s. 622-627.

2. Iwanow, V. T. Białka układu odpornościowego. podręcznik zasiłek / V. T. Iwanow; Instytut Chemii Bioorganicznej im. M. M. Shemyakina. -M.: IBKhRAN, 1997. - 114 s.

3. Buchner, J. Renaturacja, oczyszczanie i charakterystyka rekombinowanych fragmentów Fab wytwarzanych w Escherichia coli / J. Buchner, R. Rudolph // Biotechnology (NY). - 1991. - Cz. 9 (2). -P.157-162.

4. Ahmad, Z. A. przeciwciało scFv: zasady i zastosowanie kliniczne / Z. A. Ahmad, S. K. Yeap, M. Hamid // Immunologia kliniczna i rozwojowa. - 2012. - Cz. 2012. - s. 3-17.

5. Dimitrov, D. S. Przeciwciała terapeutyczne: stan obecny i przyszłe trendy – czy wkrótce nastąpi zmiana paradygmatu? / D. S. Dimitrov, J. D. Marks // Metody w biologii molekularnej. - 2009. - Cz. 525. -P. 1-27

6. Jez, J. Znaczący wpływ pojedynczych reszt N-glikanu na aktywność biologiczną fragmentów przeciwciałopodobnych na bazie Fc / J. Jez, A. Castilho, H. Steinkellner // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Cz. 29. - s. 24313-24319.

7. Strebe, N. Cloning of Variable Domains from Mouse Hybridoma by PCR / N. Strebe, D. Moosmayer, S. Dubel // Antibody Engineering. -2010. - Tom. 1. - s. 3-14.

8. Rohatgi, S. Systematyczne projektowanie i testowanie zagnieżdżonych starterów (RT-)PCR do specyficznej amplifikacji mysich genów regionu zmiennego immunoglobuliny z rearanżacją/ekspresją z małej liczby komórek B / S. Rohatgi, P. Ganju, D. Sehgal // Dziennik metod immunologicznych. - 2008. -Tom. 330. - s. 205-219.