Fragmenty protilátek v terapii. Fab fragment protilátky. Kompletní protilátky. Nekompletní protilátky. Fc fragment protilátky Referenční knihy, video přednášky, protokoly

Protilátky (Ab) jsou efektorové molekuly humorální imunity. Syntéza protilátek je spouštěna tím, že Ag se dostanou do těla zvenčí (při infekcích, očkování, expozici xenobiotikům) nebo se tvoří endogenně. AT zpravidla specificky interaguje s komplementárním Ag. Existují však protilátky, které interagují s determinantami Ag společnými pro různé Ag. Takové protilátky jsou známé jako zkříženě reagující nebo heterospecifické.

Protilátky přicházejí v milionech variant a každá molekula má jedinečné vazebné místo pro determinantu antigenu. Ve většině případů jsou prezentovány protilátky sérové ​​glykoproteiny, migrující jako součást pomalé frakce gamaglobulinů během elektroforézy sérových proteinů. Proto se někdy k označení sérové ​​AT frakce používá termín „gama“. -globuliny».

Protilátky se také nazývají imunoglobuliny". Protilátky (Ab) tvoří jednu z hlavních frakcí krevních bílkovin, které tvoří 20 % hmotnosti celkové plazmatické bílkoviny. AT jsou odolné vůči slabým kyselinám a zásadám a také vůči zahřátí do 60 °C.

Strukturní jednotkou AT je monomer – válcová molekula sestávající ze dvou stejných těžkých H-řetězců [z angl. těžký, těžký] a dva stejné lehké L-řetězce [z angl. světlo] Těžké a lehké řetězce Ig se skládají z aminokyselinových zbytků a jsou spojeny disulfidovými (-S-S-) vazbami. V řetězcích se rozlišuje variabilní oblast nebo V-region. různý, různý] a konstantní oblast nebo C-region [z angl. stálý, stálý]. Oblast V se mezi AT liší. V-oblasti L- a H-řetězců tvoří Ag-vazebné centrum (AT aktivní centrum, paratop), neboli Fab fragment [z angl. fragment fragmentu, + vazba antigenu, vazba Ag]. Konstantní oblast molekuly se nazývá Fc fragment. fragment krystalizovatelný, fragment krystalizace].

Na spojení fragmentů Fab a Fc je pantová oblast, která umožňuje fragmentům vázajícím Ag rozvinout pro bližší kontakt s Ag.

Oblast molekuly protilátky (Fab) určuje antigenní specificitu a Fc provádí efektorové funkce.

Fab fragmenty protilátek interagují s antigenními determinantami. Ag-vazebné centrum je komplementární k Ag epitopu (princip zámku klíče). Vazba Ag na AT je nekovalentní a reverzibilní. Afinita (afinita) Ag k protilátce je určena fyzikálně-chemickými vlastnostmi interagujících molekul a poměrem koncentrací vázaného a volného Ag a protilátek. Afinita je ovlivněna prostorovou korespondencí interagujících oblastí molekul, elektrostatickými, hydrofobními interakcemi a van der Waalsovými silami.

Avidita- integrální charakteristika síly vazby mezi Ag a AT, s přihlédnutím k interakci všech aktivních center s Ag epitopy.

Valence protilátky- počet aktivních (Ag-vazebných) center protilátek. Kompletní molekula Ig je alespoň divalentní. Takové protilátky jsou známé jako kompletní protilátky; monomery s nižší valencí jsou neúplné protilátky.

Kompletní protilátky(zejména IgM, IgG) způsobují agregaci Ag, viditelnou pouhým okem (například RA bakterií).

Nekompletní protilátky obsahují jedno Ag-vazebné centrum, a proto jsou monovalentní (například protilátky produkované při brucelóze). Druhé Ag-vazebné centrum takových Ig je stíněno různými strukturami nebo má nízkou aviditu.

Nekompletní protilátky jsou funkčně defektní, protože nejsou schopny agregovat Ag. Nekompletní AT mohou vázat Ag epitopy, čímž brání kompletním protilátkám v kontaktu s nimi; proto se jim také říká blokující protilátky.

Fc fragment protilátky

Konstantní oblasti těžkých řetězců určují povahu interakcí protilátky s buňkami a molekulami imunitního systému, zejména specifitu vazby molekuly Ig na efektorové buňky (například fagocyty, žírné buňky), které nesou receptory pro Fc fragment na jejich povrchu.

Fc fragment také určuje efektorové funkce protilátky (například aktivaci komplementu). Pro realizaci těchto vlastností dochází ihned po navázání Ag na Fab fragmenty ke konformačním změnám ve struktuře Fc fragmentů. Prostorově změněné Fc fragmenty jsou rozpoznávány fagocyty, přispívají k fixaci C1a složky komplementu a spuštění komplementární kaskády podél klasické dráhy. Jinak by ani buňky, ani efektorové molekuly nebyly schopny rozlišit mezi intaktní AT a protilátkami, které navázaly Ag.

Interakce protilátek s antigenem zahrnuje specifické a nespecifické fáze.

Specifická fáze probíhá rychle a představuje specifickou interakci aktivního centra s Ag.

Nespecifická fáze probíhá pomaleji a závisí na přítomnosti elektrolytů a vlastnostech Ag. Korpuskulární Ag agregují do hrubých konglomerátů a srážejí se (aglutinační fenomén).

Rozpustné Ag tvoří jemně rozptýlené konglomeráty (precipitační fenomén), projevující se zákalem roztoku nebo tvorbou precipitačních prstenců či precipitačních zón v gelech.

Existují dva typy konstantních oblastí lehkého řetězce - kappa (k) a lambda; Konstantní osudy těžkých řetězců jsou reprezentovány pěti hlavními formami - mu (p), gama (y), delta (8), alfa (a) a epsilon (e). Každý z nich je spojen se samostatnou třídou Ig. Existuje 5 tříd AT: IgA, IgD, IgE, IgG a IgM.

Molekuly IgG, IgD a IgE jsou reprezentovány monomery, IgM - pentamery; Molekuly IgA v krevním séru jsou monomery a ve vylučovaných tekutinách (slzná tekutina, sliny, sekrety sliznic) jsou dimery.

IgM jsou syntetizovány po počátečním vstupu Ag do těla. Vrchol tvorby nastává 4.-5. den, následovaný poklesem titru. Tvorba IgM na některé Ag (například bičíkové Ag bakterií) probíhá nepřetržitě. IgM zahrnuje významnou část AT produkovaného Ag gramnegativních bakterií.

Přítomnost IgM vůči Ag specifického patogenu indikuje akutní infekční proces.

Molekula IgM je pentamer; pět podjednotek je spojeno J-řetězcem [z angl. spojování, vazba], v důsledku čehož molekula IgM získává 10 Ag-vazebných míst.

Molekuly IgM opsonizují, aglutinují, precipitují a lyžují struktury obsahující Ag a také aktivují systém komplementu podél klasické dráhy (pro komplement-dependentní lýzu bakterií stačí jedna molekula IgM).

Imunoglobulin G (IgG)- hlavní třída AT (až 75 % všech Ig), chránící tělo před bakteriemi, viry a toxiny. Po počátečním kontaktu s Ag je syntéza IgM obvykle nahrazena tvorbou IgG.

Maximální titry IgG během primární odpovědi jsou pozorovány ve dnech 6-8. Detekce vysokých titrů IgG vůči Ag konkrétního patogenu naznačuje, že tělo je ve fázi rekonvalescence nebo že konkrétní onemocnění nedávno prodělalo. Zvláště velká množství IgG jsou syntetizována během sekundární odpovědi.

IgG je reprezentován 4 podtřídami: IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4; jejich relativní obsah (v %) je 66-70, 23, 7-8 a 2-4. IgG se přímo účastní imunitních cytolytických reakcí, neutralizačních reakcí a také zesiluje fagocytózu, působí jako opsoniny a váže receptory Fc fragmentů v membráně fagocytárních buněk (v důsledku toho fagocyty účinněji absorbují a lyžují mikroorganismy).

Pouze IgG je schopen proniknout do placenty, což zajišťuje vytvoření pasivní imunity u plodu.

Imunoglobulin A (IgA) cirkulují v krevním séru (představují 15-20 % všech Ig) a jsou také vylučovány na povrch epitelu. Přítomný ve slinách, slzné tekutině, mléce a na povrchu sliznic.

AT třídy IgA zvyšují ochranné vlastnosti sliznic trávicího traktu, dýchacích cest, pohlavních a močových cest. V krevním séru cirkuluje IgA ve formě dvojmocných monomerů; v sekretovaných tekutinách převládají čtyřvazné dimery obsahující jeden J-řetězec a další molekulu polypeptidu (sekreční složka syntetizovaná epiteliálními buňkami).

Tato molekula se váže na monomery IgA během jejich transportu epiteliálními buňkami na povrch sliznic. Sekreční složka se podílí nejen na vazbě molekul IgA, ale zajišťuje jejich intracelulární transport a uvolňování na povrch sliznic a také chrání IgA před trávením proteolytickými enzymy.

Molekuly IgA se účastní reakcí neutralizace a aglutinace patogenů. Kromě toho se po vytvoření komplexu Ag-AT podílejí na aktivaci komplementu prostřednictvím alternativní dráhy.

Imunoglobulin E (IgE) specificky interagují s mastocyty a bazofilními leukocyty obsahujícími četná granule s biologicky aktivními látkami. Jejich uvolnění z buňky (degranulace) způsobí prudké rozšíření lumen venul a zvýšení propustnosti jejich stěn. Podobný obraz lze pozorovat u alergických reakcí (například bronchiální astma, alergická rýma, kopřivka).

Ag-vazebné Fab fragmenty molekuly IgE specificky interagují s Ag, který vstupuje do těla. Vytvořený imunitní komplex interaguje s receptory Fc fragmentů IgE uložených v buněčné membráně bazofilu nebo žírné buňky. Tato interakce je signálem pro degranulaci s uvolňováním histaminu a dalších biologicky aktivních látek a rozvojem akutní alergické reakce.

Fab fragmenty protilátek interagovat s antigenními determinantami. Ag-vazebné centrum je komplementární k Ag epitopu (princip zámku klíče). Vazba Ag na AT je nekovalentní a reverzibilní. Afinita (afinita) Ag k protilátkám určeno fyzikálně-chemickými vlastnostmi interagujících molekul a poměrem koncentrací vázaného a volného Ag a protilátky. Afinita je ovlivněna prostorovou korespondencí interagujících oblastí molekul, elektrostatickými, hydrofobními interakcemi a van der Waalsovými silami.

Avidita- integrální charakteristika síly vazby mezi Ag a AT, s přihlédnutím k interakci všech aktivních center s Ag epitopy.

Valence protilátky- počet aktivních (Ag-binding) center protilátky. Kompletní molekula Ig je alespoň divalentní. Takový protilátky známý jako kompletní protilátky; monomery s nižší valencí - neúplné protilátky.

Kompletní protilátky(zejména IgM, IgG) způsobují agregaci Ag, viditelnou pouhým okem (například RA bakterií).

Nekompletní protilátky obsahují jedno Ag-vazebné centrum a jsou tedy monovalentní (např. protilátky produkovaný při brucelóze). Druhé Ag-vazebné centrum takových Ig je stíněno různými strukturami nebo má nízkou aviditu.

Nekompletní protilátky funkčně vadné, protože nejsou schopny agregovat Ag. Nekompletní AT může vázat Ag epitopy a bránit tak kontaktu s nimi plné protilátky; proto se jim také říká blokující protilátky.

Fc fragment protilátky

Konstantní oblasti těžkých řetězců určují povahu interakcí protilátky s buňkami a molekulami imunitního systému, zejména specifičnost vazby molekuly Ig na efektorové buňky (například fagocyty, žírné buňky), které na svém povrchu nesou receptory pro Fc fragment.

Fc fragment také určuje efektor funkce protilátek(například aktivace komplementu). Pro realizaci těchto vlastností dochází ihned po navázání Ag na Fab fragmenty ke konformačním změnám ve struktuře Fc fragmentů. Prostorově změněné Fc fragmenty jsou rozpoznávány fagocyty, přispívají k fixaci C1a složky komplementu a spuštění komplementární kaskády podél klasické dráhy. Jinak by ani buňky, ani efektorové molekuly nebyly schopny rozlišit mezi intaktní AT resp protilátky, spojený Ag.

1. Téma přednášky:„Humorální imunitní systém. Struktura imunoglobulinu G"

2. Účel: Seznámit studenty s hlavními funkcemi B-imunitního systému, zvážit hlavní fáze diferenciace B-lymfocytů, strukturu a funkce imunoglobulinu G.

3. Abstrakty přednášek:

Základní funkce B-systému.

Chemická struktura imunoglobulinu G.

Funkce Fab a Fc fragmentů imunoglobulinů

Humorální imunitní systém je specializovaný systém, jehož hlavní funkcí je syntéza protilátek proti antigenům. Funkční aktivita humorálního imunitního systému ve většině případů závisí na úzké interakci s T-imunitním systémem a buňkami prezentujícími antigen.

Hlavními buňkami humorálního imunitního systému jsou B lymfocyty, zodpovědné za syntézu protilátek. Účast protilátek na realizaci humorální imunitní odpovědi je spojena s tvorbou imunitních komplexů s rozpustnými a korpuskulárními antigeny. Jako součást imunitních komplexů jsou antigeny izolovány a/nebo zničeny.

Hlavní funkcí protilátek je specifická vazba antigenu. Specifická interakce antigenů a protilátek je založena na prostorové korespondenci nebo komplementaritě, která mezi nimi existuje.

Molekula IgG obsahuje 4 polypeptidové řetězce: 2 těžké a 2 lehké. Aminokyseliny tzv. hypervariabilní oblasti V-domény přicházejí do přímého kontaktu s antigenem. Dutina aktivního centra se nachází mezi variabilními oblastmi těžkého a lehkého řetězce a přesně svým tvarem odpovídá specifické haptenové skupině. Fragment obsahující konstantní domény obou těžkých řetězců (2 CH 2 a 2 CH 3) se nazývá Fc fragment.

Hlavní funkce fragmentů Fab a Fc

Hlavní funkcí Fab fragmentu je vazba antigenu , protože obsahuje aktivní centrum vázající antigen molekuly imunoglobulinu, tvořené doménami VH a VL těžkého a lehkého řetězce.

Funkce Fc fragmentu:

1. Různé třídy imunoglobulinů se liší ve struktuře Fc fragmentů. Tyto rozdíly se mohou týkat jak počtu domén CH obsažených ve fragmentech Fc, tak jejich složení aminokyselin (mohou existovat další domény, například CH4 v IgM a IgE). Kvůli rozdílům ve struktuře Fc fragmentů se třídy imunoglobulinů liší také funkcí.

2. Pomocí Fc fragmentů dochází k polymeraci molekul imunoglobulinu. Například sekreční IgA tvoří dimery a trimery, sérový IgM je pentamer.

3. V Fc fragmentech IgM, IgG 1 a IgG 3 po navázání na antigen dochází ke strukturální změně, v jejímž důsledku se v oblasti domény CH 2 objeví aktivní místo, které váže první složku komplementového systému, proto tyto třídy imunoglobulinů u lidí způsobují aktivaci systému komplementu klasickou cestou.

4. Pomocí Fc fragmentů jsou molekuly imunoglobulinů integrovány do plazmatické membrány B lymfocytů a jsou receptory rozpoznávající antigen.

5. Na povrchu mnoha buněk v těle jsou Fc receptory pro různé třídy imunoglobulinů. Pokud jsou k těmto receptorům připojeny odpovídající imunoglobuliny nebo imunitní komplexy obsahující tyto imunoglobuliny, pak prostřednictvím těchto receptorů může dojít k aktivaci nebo potlačení funkcí odpovídajících buněk .

4. Ilustrační materiál: multimediální přednáška č. 2

Fab fragment (lat. fragmentum fragment, kus)

část molekuly imunoglobulinu, štěpená papainem a sestávající z lehkého řetězce a amino-koncové poloviny těžkého řetězce; nese antideterminant.

1. Malá lékařská encyklopedie. - M.: Lékařská encyklopedie. 1991-96 2. První pomoc. - M.: Velká ruská encyklopedie. 1994 3. Encyklopedický slovník lékařských termínů. - M.: Sovětská encyklopedie. - 1982-1984.

Podívejte se, co je „Fab fragment“ v jiných slovnících:

- ... Wikipedie

Tento článek je o imunologii. Pro ukrajinskou pop rockovou skupinu, viz Antibodies (skupina); pro film, viz Protilátky (film, 2005). Protilátky (imunoglobuliny, IG, Ig) jsou speciální třídou glykoproteinů přítomných na ... ... Wikipedia

- (Ig), skupina chemicky příbuzných. povaha a vlastnosti globulárních proteinů obratlovců a lidí, které obvykle mají protilátky, tj. specifické. schopnost vázat se na antigen, což stimuluje jejich tvorbu. I. jsou vyráběny v ...... Chemická encyklopedie

I Protilátky jsou proteiny v krevním séru a jiných biologických tekutinách, které jsou syntetizovány v reakci na zavedení antigenu a mají schopnost specificky interagovat s antigenem, který způsobil jejich tvorbu, nebo s izolovanou determinantou... Lékařská encyklopedie

Proteiny skupiny imunoglobulinů, které se tvoří v těle člověka a teplokrevných živočichů v reakci na pronikání látek (antigenů) a neutralizující jejich škodlivé účinky. Hlavní formy projevu aktivity A. jsou aglutinace, precipitace,... ... Slovník mikrobiologie

Účinná látka ›› Abciximab* (Abciximab*) Latinský název ReoPro ATX: ›› B01AC13 Abciximab Farmakologická skupina: Protidestičkové látky Nozologická klasifikace (ICD 10) ›› I20 Angina [angina pectoris] ›› I20.0 Nestabilní… … Slovník léků

DUŠE- [Řecký ψυχή] tvoří spolu s tělem složení osoby (viz články Dichotomismus, Antropologie), přičemž je samostatným principem; Obraz člověka obsahuje obraz Boha (podle některých církevních otců, podle jiných je obraz Boha obsažen ve všem... ... Ortodoxní encyklopedie

- (Apollo, Απόλλων). Sluneční božstvo, syn Dia a Leta (Latona), dvojče bohyně Artemis. Apollo byl také považován za boha hudby a umění, boha věštění a patrona stád a dobytka. Aktivně se podílí na zakládání měst a vlády... Encyklopedie mytologie

DIONYSIUS VELIKÝ- [Řecký Διονύσιος ὁ Μέγας] (konec II. stol. 264/5), sv., španěl. (památka 5. října, řecká památka 3. října), biskup. Alexandrijec, teolog, církevní veřejný činitel. Život Hlavním zdrojem D.V. biografie jsou spisy Eusebia z Cesareje... ... Ortodoxní encyklopedie

- (Actaeon, Άχταίων). Slavný lovec, syn Aristaea a Autonie. Jednou na lovu viděl Artemis koupat se a její nymfy, za což byl bohyní proměněn v jelena a jeho 50 psů ho roztrhalo na kusy. Podle jiné legendy ho Artemis proměnila v jelena za... ... Encyklopedie mytologie

- (Άθηνά), v řecké mytologii bohyně moudrosti a spravedlivé války. Předřecký původ obrazu A. nám nedovoluje odhalit etymologii jména bohyně, vycházející pouze z řečtiny. Mýtus o narození A. z Dia a Metis („moudrost“, ... ... Encyklopedie mytologie

UDC 577.322.24

D. O. Dormeshkin, student magisterského studia (BSTU);

V. N. Leontiev, kandidát chemických věd, docent, vedoucí katedry (BSTU);

I. G. Ivashkevich, kandidát chemických věd (IBOC NAS Běloruska);

A. A. Gilep, kandidát chemických věd, vedoucí laboratoře (IBOC NAS Běloruska)

ZÍSKÁNÍ REKOMBINANTNÍCH FAB FRAGMENTŮ PROTILÁTEK SPECIFICKÝCH PRO KORTISOL

V této práci bylo provedeno molekulární klonování genů kódujících strukturu myších imunoglobulinů, které se specificky vážou na steroidní hormon kortizol. Pro tento účel byly navrženy primery tak, aby pokryly celou rodinu genů kódujících strukturu imunoglobulinů třídy G. Pro účinnou expresi rekombinantních protilátek v buňkách Escherichia coli byly vytvořeny molekulárně genetické konstrukty. Byla provedena heterologní exprese Fab fragmentů protilátek. Rekombinantní protein se získá v homogenním stavu.

Článek se zabývá molekulárním klonováním genů kódujících strukturu myších imunoglobulinů, které mohou specificky vázat steroidní hormon kortizol. Pro tyto účely byly zkonstruovány primery pokrývající všechny rodiny genů, které kódují strukturu imunoglobulinů G a molekulárně-genetické konstrukce pro účinnou expresi rekombinantních protilátek v Escherichia coli. Byla provedena heterologní exprese Fab-fragmentů. Rekombinantní protein byl izolován v homogenním stavu.

Úvod. Kortizol (obrázek 1) je jedním z nejdůležitějších steroidních hormonů a je nezbytný pro udržení mnoha tělesných funkcí. Stejně jako ostatní glukokortikosteroidy je kortizol syntetizován v zona fasciculata kůry nadledvin ze společného prekurzoru cholesterolu. Měření hladiny steroidního hormonu kortizolu v krvi má velký význam pro sledování funkce hypofýzy a kůry nadledvin. V současné době existuje velké množství diagnostických systémů pro kvantitativní stanovení kortizolu v biologických tekutinách. Většina z nich tak či onak využívá principu afinitního rozpoznávání kortizolu odpovídajícími protilátkami (imunoglobuliny). Naléhavým úkolem je zlepšit funkční vlastnosti rozpoznávacího modulu diagnostických systémů a také snížit jejich cenu. Jedním z možných způsobů řešení tohoto problému je použití rekombinantních protilátek, které mají širší rozsah vlastností ve srovnání s protilátkami plné délky.

Rýže. 1. Strukturní vzorec kortizolu

Imunoglobuliny jsou skupinou glykoproteinů přítomných v krevní plazmě a

tkáňové tekutiny obratlovců, schopné rozpoznávat a vázat tělu cizí látky (antigeny). Oblast antigenu, se kterou protilátka interaguje, se nazývá epitop a oblast protilátky, přes kterou interaguje s antigenem, se nazývá paratop.

U vyšších savců jsou imunoglobuliny zastoupeny v pěti třídách: IgO, IgM, IgA, IgE a IgB. Největší praktický zájem je o nejběžnější třídu - ^O, která je v lidském těle zastoupena čtyřmi podtřídami (izotypy): ^1, ^2, DOZ a ^4.

Imunoglobulin je multimerní protein skládající se ze dvou identických těžkých řetězců a dvou lehkých řetězců (obr. 2).

Těžký řetěz Lehký řetěz

Rýže. 2. Struktura molekuly imunoglobulinu

232 ISSN 1683-0377. Sborník BSTU. 2013. č. 4. Chemie, technologie organických látek a biotechnologie

Molekula imunoglobulinu může být podmíněně rozdělena na dvě funkční podjednotky - fragment Fab (vazba fragmentu-antigen) a fragment Fc (krystalizovatelný fragment). Fc fragment se skládá ze dvou párů konstantních domén (CH2 a CH3) a je zodpovědný za interakci s buněčnými receptory během aktivace imunitní odpovědi a také s proteiny komplementového systému. Fragment Fab se účastní rozpoznávání antigenu a skládá se z jedné variabilní oblasti (VL a VH) a jedné konstantní oblasti (CL a CH1). Jednotlivé polypeptidové řetězce jsou navzájem spojeny disulfidovými vazbami a nekovalentními interakcemi. Navíc na úrovni oblasti CH2 je molekula glykosylována.

S rozvojem molekulárně genetických technologií se rozšířily miniprotilátky: fragmenty Fab- (vazba fragmentu antigenu) a scFv- (variabilní jednořetězcový fragment), které jsou schopné specificky vázat antigen, ale mají větší schopnost pronikat než protilátky plné velikosti. protilátky. Fragment Fab je protein o velikosti 50 kDa sestávající z oblasti těžkého řetězce (VH a CH1) a lehkého řetězce spojených dohromady disulfidovými vazbami a nekovalentními interakcemi. Fragment sestávající pouze z variabilních oblastí (VH a VL) spojených peptidovým linkerem je scFv fragment a má molekulovou hmotnost 15 kDa. Rekombinantní miniprotilátky mohou být produkovány v bakteriálním expresním systému, na rozdíl od imunoglobulinů s plnou délkou, jejichž Fc doména je glykosylovaná, a proto vyžaduje posttranslační modifikační systémy. Struktura a v souladu s tím fyzikálně-chemické vlastnosti protilátkových fragmentů jsou snadno manipulovatelné na genové úrovni a mohou být převedeny na protilátky plné délky, aby získaly efektorové funkce.

Hlavní část. Hlavním cílem bylo získat vysoce afinitní Fab fragmenty protilátek proti steroidnímu hormonu kortizolu.

Monoklonální protilátky produkované hybridomy 5G-H2 (získané v Laboratoři chemie proteinových hormonů Ústavu bioorganické chemie Národní akademie věd Běloruska) jsou schopny se specificky vázat na steroidní hormon kortizol. Použití hybridomových linií produkujících monoklonální protilátky má však řadu významných nevýhod, které zahrnují nestabilitu buněčných linií, vysoké náklady na kultivaci a nemožnost provádět genetické manipulace s imunoglobulinovými geny. Navíc obdržel

Při použití hybridomové technologie mohou protilátky obsahovat příměsi myších imunoglobulinů, které při použití v diagnostických systémech zvyšují pravděpodobnost falešných výsledků. Všechna tato omezení lze překonat použitím rekombinantních protilátek získaných pomocí metod genetického inženýrství a exprimovaných v bakteriálním systému.

Prvním krokem byla izolace celkové RNA z 5G-H2 hybridomů, které produkují specifické protilátky proti steroidnímu hormonu kortizolu. Celková RNA byla izolována pomocí soupravy SV Total RNA Isolation kit (Promega) a byla okamžitě použita k provedení reverzní transkripční reakce s oligo-IgT)18 primery za účelem získání cDNA (souprava činidel Reverta-L z Centrálního výzkumného ústavu epidemiologie Rospotrebnadzor byl použit).

Výsledná cDNA byla použita jako templát pro amplifikaci genů kódujících struktury těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů. Na základě analýzy literárních údajů a nukleotidových sekvencí imunoglobulinů z databáze IMGT.org byly navrženy specifické degenerované primery tak, aby pokryly celou diverzitu genů cDNA kódujících lehké a těžké řetězce myších imunoglobulinů třídy G. Amplifikace byla provedena v zesilovači BioRad T100 za následujících podmínek: denaturace 94 °C po dobu 4 minut; 30 cyklů - denaturace 94°C 1 min, žíhání 55°C 1 min, elongace 72°C 1 min. Konečná fáze prodlužování je -72 °C po dobu 10 minut.

Amplifikované fragmenty byly separovány gelovou elektroforézou ve 2% agarózovém gelu za použití TAE pufru v přítomnosti ethidium bromidu (výsledky byly zaznamenány pomocí videosystému Gel Imager 2 (Vilber Lourmat)). V každém případě byly provedeny pozitivní a negativní amplifikační kontroly.

Po PCR byly amplifikační produkty klonovány do vektoru pXcmkn12 a sekvenovány pro potvrzení správné sekvence klonované DNA (nukleotidová sekvence byla stanovena pomocí ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycler Sequencing Kit, Big Dye X Terminator Purification Kit a sekvenátor Applied Biosystems 3130). Sekvenování ukázalo, že klonovaný těžký řetězec byl typu G2a, což je v souladu s izotypem protilátek produkovaných hybridomem, a lehký řetězec byl typu k.

Pro expresi Fab fragmentů protilátek, speciálně navržený

plazmidový vektor pCW-Fab, poskytující vysokou úroveň exprese rekombinantních protilátek v periplazmatickém prostoru Escherichia coli.

Pro preparativní expresi byly použity buňky E. coli DH5a transformované bicistronním vektorem pCW-Fab obsahujícím klonované geny Fab domény.

Kultivace buněk E. coli DH5a byla prováděna v TB médiu. Indukce buněčné kultury k proteinové syntéze byla provedena pomocí IPTG (isopropyl^^-1-thiogalakto-pyranosid), který spouští transkripci prostřednictvím indukce laktózového operonu.

Buňky byly zničeny pomocí homogenizéru Emulsiflex-C5 s přídavkem detergentu (CHAPS), inhibitoru serinové proteázy (PMSF) a ß-merkaptoethanolu. Zničené buňky byly odděleny centrifugací. Supernatant byl nanesen na chromatografickou kolonu s ProteinA Sepharosou. ProteinA je protein exprimovaný v buňkách Staphylococcus aureus a schopný afinitně se vázat na doménu CH1 těžkého řetězce imunoglobulinů. To umožňuje použití afinitní chromatografie k izolaci rekombinantních fragmentů Fab (izolace proteinu Bio-Rad „Bio-Logic“. a byl použit systém čištění).

Homogenita výsledného proteinu byla sledována pomocí PAGE elektroforézy za denaturačních podmínek, která prokázala přítomnost dvou polypeptidových řetězců s očekávanou molekulovou hmotností, což potvrzuje účinnost vytvořených konstruktů. Funkční aktivita rekombinantních Fab fragmentů protilátek vyžaduje další studium.

Závěr. Bylo provedeno molekulární klonování genů kódujících strukturu myších imunoglobulinů specifických pro kortizol. Výsledky sekvenování potvrdily, že klonované fragmenty patřily do třídy imunoglobulinů. Vytvořené molekulárně genetické konstrukty umožnily provést heterologní expresi rekombinantních Fab fragmentů v buňkách E. coli. Rekombinantní protein byl získán v homogenním stavu s molekulovou hmotností, která odpovídala očekáváním. Vlastnosti výsledných fragmentů Fab protilátky vyžadují další studium.

Kolektiv autorů vyjadřuje poděkování Laboratoři chemie proteinových hormonů a osobně doktoru chemických věd O. V. Sviridovovi a kandidátovi chemických věd Ivashkevich I. G. za laskavé poskytnutí buněčných linií hybridomu 5G-H2.

Literatura

1. Spironelli, C. Kortizol a plazmatické hladiny ACTH u mateřských filicidů a násilných psychiatrických žen / C. Spironelli, F. J. Gradante // Psychiatr Res. - 2013. - Sv. 47. - S. 622-627.

2. Ivanov, V. T. Proteiny imunitního systému. učebnice příspěvek / V. T. Ivanov; Ústav bioorganické chemie pojmenovaný po. M. M. Shemyakina. -M.: IBKhRAN, 1997. - 114 s.

3. Buchner, J. Renaturace, purifikace a charakterizace rekombinantních Fab-fragmentů produkovaných v Escherichia coli / J. Buchner, R. Rudolph // Biotechnology (NY). - 1991. - Sv. 9 (2). -S.157-162.

4. Ahmad, Z. A. scFv Antibody: Principles and Clinical Application / Z. A. Ahmad, S. K. Yeap, M. Hamid // Clinical and Developmental Immunology. - 2012. - Sv. 2012. - S. 3-17.

5. Dimitrov, D. S. Terapeutické protilátky: současný stav a budoucí trendy – nastává brzy změna paradigmatu? / D. S. Dimitrov, J. D. Marks // Methods in Molecular Biology. - 2009. - Sv. 525. -P. 1-27

6. Jez, J. Significant Impact of Single N-Gly-can Residues on the Biological Activity of Fc-based Antibody-like Fragments / J. Jez, A. Castilho, H. Steinkellner // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Sv. 29. - S. 24313-24319.

7. Strebe, N. Cloning of Variable Domains from Mouse Hybridoma by PCR / N. Strebe, D. Moosmayer, S. Dubel // Antibody Engineering. -2010. - Sv. 1. - S. 3-14.

8. Rohatgi, S. Systematický design a testování nested (RT-)PCR primerů pro specifickou amplifikaci myších přeuspořádaných/exprimovaných genů variabilní oblasti imuno-noglobulinu z malého počtu B-buněk / S. Rohatgi, P. Ganju, D. Sehgal // Journal of Immunological Methods. - 2008. -Sv. 330. - S. 205-219.