Фрагменти от антитела в терапията. Fab фрагмент от антитяло. Пълни антитела. Непълни антитела. Fc фрагмент от антитяло Справочници, видео лекции, протоколи

Антителата (Ab) са ефекторни молекули на хуморалния имунитет. Синтезът на антитела се задейства от Ags, навлизащи в тялото отвън (по време на инфекции, ваксинация, излагане на ксенобиотици) или образувани ендогенно. Като правило, AT специфично взаимодейства с комплементарния Ag. Има обаче антитела, които взаимодействат с детерминантите на Ag, общи за различните Ag. Такива антитела са известни като кръстосано реагиращи или хетероспецифични.

Антителата се предлагат в милиони разновидности и всяка молекула има уникално антиген детерминантно свързващо място. В повечето случаи се представят антитела серумни гликопротеини, мигриращи като част от бавната фракция на гама глобулини по време на електрофореза на серумни протеини. Следователно терминът "гама" понякога се използва за обозначаване на серумната АТ фракция. -глобулини».

Антителата също се наричат имуноглобулини". Антителата (Ab) образуват една от основните фракции на кръвните протеини, представляващи 20% от масата на общия плазмен протеин. AT са устойчиви на слаби киселини и основи, както и на нагряване до 60 °C.

Структурната единица на АТ е мономер - цилиндрична молекула, състояща се от две еднакви тежки Н-вериги [от англ. тежък, тежък] и две еднакви леки L-вериги [от англ. светлина] Тежките и леките вериги на Ig се състоят от аминокиселинни остатъци и са свързани чрез дисулфидни (-S-S-) връзки. Във веригите се разграничава променлива област или V-област. различни, различни] и постоянна област, или C-регион [от английски. постоянен, постоянен]. Регионът V варира между AT. V-регионите на L- и H-веригите образуват Ag-свързващия център (AT активен център, паратоп), или Fab фрагмент [от английски. фрагмент фрагмент, + антиген свързване, свързване Ag]. Постоянната област на молекулата се нарича Fc фрагмент. фрагмент, който може да кристализира, фрагмент от кристализация].

На кръстовището на Fab и Fc фрагментите има шарнирна област, която позволява на Ag-свързващите фрагменти да се разгънат за по-близък контакт с Ag.

Областта на молекулата на антитялото (Fab) определя специфичността на антигена, а Fc изпълнява ефекторни функции.

Fab фрагменти от антитела взаимодействат с антигенни детерминанти. Ag-свързващият център е комплементарен на Ag епитопа (принцип на ключ-заключване). Свързването на Ag към AT е нековалентно и обратимо. Афинитетът (афинитетът) на Ag към антитяло се определя от физикохимичните свойства на взаимодействащите молекули и съотношението на концентрациите на свързани и свободни Ag и антитела. Афинитетът се влияе от пространственото съответствие на взаимодействащи области на молекули, електростатични, хидрофобни взаимодействия и ван дер Ваалсови сили.

Авидност- интегрална характеристика на силата на връзката между Ag и AT, като се отчита взаимодействието на всички активни центрове с Ag епитопите.

Валентност на антителата- брой активни (Ag-свързващи) центрове на антитела. Цялата Ig молекула е поне двувалентна. Такива антитела са известни като пълни антитела; мономерите с по-ниска валентност са непълни антитела.

Пълни антитела(по-специално IgM, IgG) причиняват агрегация на Ag, видима с просто око (например RA на бактерии).

Непълни антителасъдържат един Ag-свързващ център и следователно са моновалентни (например антитела, произведени при бруцелоза). Вторият Ag-свързващ център на такива Igs е екраниран от различни структури или има нисък авидитет.

Непълните антитела са функционално дефектни, защото не са в състояние да агрегират Ag. Непълните АТ могат да свързват Ag епитопи, предотвратявайки контакта на пълните антитела с тях; затова се наричат ​​още блокиращи антитела.

Fc фрагмент на антитяло

Постоянните региони на тежките вериги определят естеството на взаимодействията на антитялото с клетките и молекулите на имунната система, по-специално специфичността на свързване на Ig молекулата с ефекторни клетки (например фагоцити, мастоцити), които носят рецептори за Fc фрагмент върху повърхността им.

Fc фрагментът също определя ефекторните функции на антитялото (например, активиране на комплемента). За да се реализират тези свойства, веднага след свързването на Ag с Fab фрагменти, настъпват конформационни промени в структурата на Fc фрагментите. Пространствено променените Fc фрагменти се разпознават от фагоцитите; те допринасят за фиксирането на C1a компонента на комплемента и стартирането на комплементарната каскада по класическия път. В противен случай нито клетките, нито ефекторните молекули биха могли да разграничат интактния АТ и антителата, които са свързали Ag.

Взаимодействието на антитела с антиген включва специфични и неспецифични фази.

Специфичната фаза протича бързо и представлява специфично взаимодействие на активния център с Ag.

Неспецифичната фаза протича по-бавно и зависи от наличието на електролити и свойствата на Ag. Корпускулярните Ags се агрегират в груби конгломерати и се утаяват (феномен на аглутинация).

Разтворимите Ag образуват фино диспергирани конгломерати (феномен на утаяване), проявяващо се чрез помътняване на разтвора или образуване на утаителни пръстени или утаителни зони в гелове.

Има два вида постоянни области на леката верига - капа (k) и ламбда; Постоянните съдби на тежките вериги са представени от пет основни форми - мю (p), гама (y), делта (8), алфа (a) и епсилон (e). Всеки от тях е свързан с отделен Ig клас. Има 5 класа AT: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM.

Молекулите IgG, IgD и IgE са представени от мономери, IgM - пентамери; Молекулите на IgA в кръвния серум са мономери, а в екскретираните течности (слъзна течност, слюнка, секрети на лигавиците) са димери.

IgMсе синтезират при първоначалното навлизане на Ag в тялото. Пикът на образуване настъпва на 4-5-ия ден, последван от намаляване на титъра. Образуването на IgM към някои Ag (например флагеларни Ag на бактерии) става непрекъснато. IgM включва значителна част от AT, произведен от Ag на грам-отрицателни бактерии.

Наличието на IgM към Ag на специфичен патоген показва остър инфекциозен процес.

Молекулата IgM е пентамер; пет субединици са свързани с J-верига [от англ. присъединяване, свързване], в резултат на което молекулата на IgM придобива 10 Ag-свързващи места.

IgM молекулите опсонизират, аглутинират, утаяват и лизират Ag-съдържащи структури и също така активират комплементната система по класическия път (една IgM молекула е достатъчна за комплемент-зависим лизис на бактерии).

Имуноглобулин G (IgG)- основният клас AT (до 75% от всички Igs), защитаващ тялото от бактерии, вируси и токсини. След първоначален контакт с Ag, синтезът на IgM обикновено се заменя с образуването на IgG.

Максимални IgG титри по време на първичния отговор се наблюдават на 6-8 дни. Откриването на високи титри на IgG към Ag на специфичен патоген показва, че тялото е в етап на реконвалесценция или че специфичното заболяване е претърпяно наскоро. Особено големи количества IgG се синтезират по време на вторичния отговор.

IgG е представен от 4 подкласа: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; относителното им съдържание (в%) е съответно 66-70, 23, 7-8 и 2-4. IgG директно участва в реакциите на имунна цитолиза, реакциите на неутрализация, а също така засилва фагоцитозата, действайки като опсонини и свързвайки Fc фрагментни рецептори в мембраната на фагоцитните клетки (в резултат на това фагоцитите абсорбират и лизират микроорганизмите по-ефективно).

Само IgG е в състояние да проникне през плацентата, което осигурява образуването на пасивен имунитет в плода.

Имуноглобулин А (IgA)циркулират в кръвния серум (представляват 15-20% от всички Ig), а също така се секретират върху повърхността на епитела. Намира се в слюнката, слъзната течност, млякото и на повърхността на лигавиците.

IgA клас АТ подобряват защитните свойства на лигавиците на храносмилателния тракт, дихателните, гениталните и пикочните пътища. В кръвния серум IgA циркулира под формата на двувалентни мономери; в секретираните течности преобладават четиривалентни димери, съдържащи една J-верига и допълнителна полипептидна молекула (секреторен компонент, синтезиран от епителни клетки).

Тази молекула се прикрепя към IgA мономерите по време на техния транспорт през епителните клетки до повърхността на лигавиците. Секреторният компонент участва не само в свързването на молекулите на IgA, но осигурява техния вътреклетъчен транспорт и освобождаване на повърхността на лигавиците, а също така предпазва IgA от разграждане от протеолитични ензими.

Молекулите IgA участват в реакциите на неутрализация и аглутинация на патогени. Освен това, след образуването на комплекса Ag-AT, те участват в активирането на комплемента по алтернативния път.

Имуноглобулин Е (IgE)специфично взаимодействат с мастоцитите и базофилните левкоцити, съдържащи множество гранули с биологично активни вещества. Излизането им от клетката (дегранулация) предизвиква рязко разширяване на лумена на венулите и повишаване на пропускливостта на стените им. Подобна картина може да се наблюдава при алергични реакции (например бронхиална астма, алергичен ринит, уртикария).

Ag-свързващи Fab фрагменти на IgE молекулата специфично взаимодействат с Ag, който влиза в тялото. Образуваният имунен комплекс взаимодейства с рецепторите на Fc фрагментите на IgE, вградени в клетъчната мембрана на базофила или мастоцита. Това взаимодействие е сигнал за дегранулация с освобождаване на хистамин и други биологично активни вещества и развитие на остра алергична реакция.

Fab фрагменти на антитяловзаимодействат с антигенни детерминанти. Ag-свързващият център е комплементарен на Ag епитопа (принцип на ключ-заключване). Свързването на Ag към AT е нековалентно и обратимо. Афинитет (афинитет) на Ag към антителаопределя се от физикохимичните свойства на взаимодействащите молекули и съотношението на концентрациите на свързано и свободно Ag и антитела. Афинитетът се влияе от пространственото съответствие на взаимодействащи области на молекули, електростатични, хидрофобни взаимодействия и ван дер Ваалсови сили.

Авидност- интегрална характеристика на силата на връзката между Ag и AT, като се отчита взаимодействието на всички активни центрове с Ag епитопите.

Валентност на антителата- брой активни (Ag-свързващи) центрове антитела. Цялата Ig молекула е поне двувалентна. Такива антителапознат като пълни антитела; мономери с по-ниска валентност - непълни антитела.

Пълни антитела(по-специално IgM, IgG) причиняват агрегация на Ag, видима с просто око (например RA на бактерии).

Непълни антителасъдържат един Ag-свързващ център и следователно са моновалентни (напр. антитела, произведени при бруцелоза). Вторият Ag-свързващ център на такива Igs е екраниран от различни структури или има нисък авидитет.

Непълни антителафункционално дефектни, тъй като не са в състояние да агрегират Ag. Непълният AT може да свърже Ag епитопи, предотвратявайки контакт с тях пълни антитела; затова се наричат ​​още блокиращи антитела.

Fc фрагмент на антитяло

Постоянните региони на тежките вериги определят естеството на взаимодействията антителас клетките и молекулите на имунната система, по-специално специфичността на свързване на Ig молекулата с ефекторни клетки (например фагоцити, мастоцити), които носят рецептори за Fc фрагмента на тяхната повърхност.

Fc фрагментсъщо определя ефекторите функции на антитела(например активиране на комплемента). За да се реализират тези свойства, веднага след свързването на Ag с Fab фрагменти, настъпват конформационни промени в структурата на Fc фрагментите. Пространствено променените Fc фрагменти се разпознават от фагоцитите; те допринасят за фиксирането на C1a компонента на комплемента и стартирането на комплементарната каскада по класическия път. В противен случай нито клетките, нито ефекторните молекули биха могли да разграничат интактните AT или антитела, свързан Ag.

1. Тема на лекцията:"Хуморална имунна система. Диференциация на В-лимфоцити. Структурата на имуноглобулин G"

2. Цел:За да запознаете учениците с основните функции на В-имунната система, разгледайте основните етапи на диференциация на В-лимфоцитите, структурата и функциите на имуноглобулин G.

3. Резюмета на лекциите:

Основни функции на В-системата.

Химическа структура на имуноглобулин G.

Функции на Fab и Fc фрагменти на имуноглобулини

Хуморална имунна система е специализирана система, чиято основна функция е синтеза на антитела срещу антигени. Функционалната активност на хуморалната имунна система в повечето случаи зависи от тясното взаимодействие с Т-имунната система и антиген-представящите клетки.

Основните клетки на хуморалната имунна система са В-лимфоцитите, отговорни за синтеза на антитела. Участието на антителата в осъществяването на хуморалния имунен отговор е свързано с образуването на имунни комплекси с разтворими и корпускулярни антигени. Като част от имунните комплекси антигените се изолират и/или унищожават.

Основната функция на антителата е специфичното антигенно свързване. Специфичното взаимодействие на антигени и антитела се основава на пространственото съответствие или комплементарност, която съществува между тях.

Молекулата на IgG съдържа 4 полипептидни вериги: 2 тежки и 2 леки. Аминокиселините на така наречената хипервариабилна област на V-домените влизат в пряк контакт с антигена. Кухината на активния център е разположена между вариабилните области на тежката и леката верига и точно съответства по форма на специфична хаптенна група. Фрагментът, съдържащ постоянните домени на двете тежки вериги (2СН2 и 2СН3) се нарича Fc фрагмент.

Основни функции на Fab и Fc фрагменти

Основната функция на Fab фрагмента е свързването на антигена , защото той съдържа активния антиген-свързващ център на имуноглобулиновата молекула, образуван от VH и VL домените на тежките и леките вериги.

Функции на Fc фрагмента:

1. Различните класове имуноглобулини се различават по структурата на Fc фрагментите.Тези разлики могат да засягат както броя на СН домените, включени в Fc фрагментите, така и техния аминокиселинен състав (може да има допълнителни домени, например СН4 в IgM и IgE). Поради разликите в структурата на Fc фрагментите, класовете имуноглобулини също се различават по функция.

2. С помощта на Fc фрагменти се извършва полимеризация на имуноглобулиновите молекули.Например секреторният IgA образува димери и тримери, серумният IgM е пентамер.

3. В Fc фрагментите на IgM, IgG 1 и IgG 3 при свързване с антиген настъпва структурна промяна, в резултат на което в областта на СН2 домейна се появява активно място, което свързва първия компонент на системата на комплемента, следователно тези класове имуноглобулини при хора предизвикват активиране на системата на комплемента по класическия път.

4. С помощта на Fc фрагменти имуноглобулиновите молекули се интегрират в плазмената мембрана на В лимфоцитите и са рецептори за разпознаване на антиген.

5. На повърхността на много клетки в тялото има Fc рецептори за различни класове имуноглобулини. Ако съответните имуноглобулини или имунни комплекси, съдържащи тези имуноглобулини, са прикрепени към тези рецептори, тогава чрез тези рецептори може да настъпи активиране или потискане на функциите на съответните клетки .

4. Илюстративен материал:мултимедийна лекция №2

Страхотен фрагмент (лат. fragmentum фрагмент, парче)

част от имуноглобулиновата молекула, разцепена от папаин и състояща се от лека верига и амино-терминална половина на тежката верига; носи антидетерминант.

1. Малка медицинска енциклопедия. - М.: Медицинска енциклопедия. 1991-96 2. Първа помощ. - М.: Велика руска енциклопедия. 1994 3. Енциклопедичен речник на медицинските термини. - М.: Съветска енциклопедия. - 1982-1984 г.

Вижте какво е „Fab фрагмент“ в други речници:

- ... Уикипедия

Тази статия е за имунологията. За украинската поп рок група вижте Антитела (група); за филма вижте Антитела (филм, 2005). Антителата (имуноглобулини, IG, Ig) са специален клас гликопротеини, присъстващи на ... ... Wikipedia

- (Ig), група химически свързани. естеството и свойствата на глобуларните протеини на гръбначните и хората, които обикновено притежават антитела, т.е. специфични. способността да се свързват с антиген, което стимулира тяхното образуване. I. се произвеждат в...... Химическа енциклопедия

I Антителата са протеини в кръвен серум и други биологични течности, които се синтезират в отговор на въвеждането на антиген и имат способността да взаимодействат специфично с антигена, причинил тяхното образуване, или с изолирана детерминанта ... Медицинска енциклопедия

Протеини от групата на имуноглобулините, образувани в тялото на хората и топлокръвните животни в отговор на навлизането на вещества (антигени) и неутрализиране на вредното им въздействие. Основните форми на проявление на активността на А. са аглутинация, утаяване, ... ... Речник по микробиология

Активна съставка ›› Абциксимаб* (Abciximab*) Латинско наименование ReoPro ATX: ›› B01AC13 Абциксимаб Фармакологична група: Антиагреганти Нозологична класификация (МКБ 10) ›› I20 Ангина [ангина пекторис] ›› I20.0 Нестабилна… … Речник на лекарствата

ДУША- [Гръцки ψυχή], заедно с тялото, образува състава на човек (вижте статиите Дихотомизъм, Антропология), като същевременно е самостоятелен принцип; Образът на човека съдържа образа на Бога (според някои отци на Църквата; според други образът на Бога се съдържа във всичко... ... Православна енциклопедия

- (Аполон, Απόλλων). Слънчево божество, син на Зевс и Лето (Латона), брат близнак на богинята Артемида. Аполон също е смятан за бог на музиката и изкуствата, бог на гадаенето и покровител на стадата и добитъка. Участва активно в основаването на градове и управление... Енциклопедия на митологията

ДИОНИСИЙ ВЕЛИКИ- [Гръцки Διονύσιος ὁ Μέγας] (края на II в. 264/5), св., исп. (памет 5 октомври, гръцка памет 3 октомври), епископ. Александриец, богослов, църковен общественик. Живот Основният източник на биографията на D.V. са писанията на Евсевий от Кесария... ... Православна енциклопедия

- (Актеон, Άχταίων). Известен ловец, син на Аристей и Автония. Веднъж по време на лов той видял да се къпе Артемида и нейните нимфи, за което бил превърнат от богинята в елен и разкъсан на парчета от своите 50 кучета. Според друга легенда Артемида го превърнала в елен за... ... Енциклопедия на митологията

- (Άθηνά), в гръцката митология богинята на мъдростта и справедливата война. Предгръцкият произход на образа на А. не ни позволява да разкрием етимологията на името на богинята, базирана само на гръцкия език. Митът за раждането на А. от Зевс и Метида („мъдрост“, ... ... Енциклопедия на митологията

UDC 577.322.24

Д. О. Дормешкин, магистър (BSTU);

В. Н. Леонтиев, кандидат на химическите науки, доцент, ръководител на катедра (BSTU);

И. Г. Ивашкевич, кандидат на химическите науки (IBOC NAS на Беларус);

А. А. Гилеп, кандидат на химическите науки, ръководител на лаборатория (IBOC NAS на Беларус)

ПОЛУЧАВАНЕ НА РЕКОМБИНАНТНИ FAB ФРАГМЕНТИ НА АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНИ КЪМ КОРТИЗОЛ

В тази работа е извършено молекулярно клониране на гени, кодиращи структурата на миши имуноглобулини, които специфично свързват стероидния хормон кортизол. За тази цел праймерите са проектирани да покриват цялото семейство от гени, кодиращи структурата на имуноглобулини от клас G. Създадени са молекулярно-генетични конструкции за ефективната експресия на рекомбинантни антитела в клетки на Escherichia coli. Беше проведена хетероложна експресия на Fab фрагменти от антитела. Рекомбинантният протеин се получава в хомогенно състояние.

Документът се спира на молекулярното клониране на гени, кодиращи структурата на миши имуноглобулини, които могат специфично да свързват стероидния хормон кортизол. За целта са конструирани праймери, обхващащи всички фамилии гени, кодиращи структурата на имуноглобулини G и молекулярно-генетични конструкции за ефективна експресия на рекомбинантни антитела в Escherichia coli. Извършена е хетероложна експресия на Fab-фрагменти. Рекомбинантен протеин е изолиран в хомогенно състояние.

Въведение. Кортизолът (Фигура 1) е един от най-важните стероидни хормони и е необходим за поддържане на много функции на тялото. Подобно на други глюкокортикостероиди, кортизолът се синтезира в zona fasciculata на надбъбречната кора от общия прекурсор холестерол. Измерването на нивото на стероидния хормон кортизол в кръвта е от голямо значение за проследяване на функцията на хипофизната жлеза и надбъбречната кора. Понастоящем има голямо разнообразие от диагностични системи за количествено определяне на кортизол в биологични течности. Повечето от тях по един или друг начин използват принципа на афинитетно разпознаване на кортизола от съответните антитела (имуноглобулини). Неотложна задача е подобряването на функционалните свойства на модула за разпознаване на диагностичните системи, както и намаляването на тяхната цена. Един от възможните начини за решаване на този проблем е използването на рекомбинантни антитела, които имат по-широк набор от свойства в сравнение с антителата с пълна дължина.

Ориз. 1. Структурна формула на кортизола

Имуноглобулините са семейство гликопротеини, присъстващи в кръвната плазма и

тъканни течности на гръбначни животни, способни да разпознават и свързват чужди за организма вещества (антигени). Областта на антигена, с която антитялото взаимодейства, се нарича епитоп, а областта на антитялото, чрез която то взаимодейства с антигена, се нарича паратоп.

При висшите бозайници имуноглобулините са представени от пет класа: IgO, IgM, IgA, IgE и IgB. Най-голям практически интерес представлява най-често срещаният клас - ^O, който в човешкото тяло е представен от четири подкласа (изотипа): ^1, ^2, DOZ и ^4.

Имуноглобулинът е мултимерен протеин, състоящ се от две идентични тежки вериги и две леки вериги (фиг. 2).

Тежка верига Лека верига

Ориз. 2. Структура на имуноглобулиновата молекула

232 ISSN 1683-0377. Сборници на BSTU. 2013. № 4. Химия, технология на органичните вещества и биотехнология

Молекулата на имуноглобулина може условно да бъде разделена на две функционални субединици - Fab фрагмент (фрагмент-антиген-свързващ) и Fc фрагмент (фрагмент, кристализиращ). Fc фрагментът се състои от две двойки постоянни домени (СН2 и СН3) и е отговорен за взаимодействието с клетъчните рецептори по време на активиране на имунния отговор, както и с протеините на системата на комплемента. Fab фрагментът участва в разпознаването на антиген и се състои от един променлив регион (VL и VH) и един постоянен регион (CL и CH1). Индивидуалните полипептидни вериги са свързани една с друга чрез дисулфидни връзки и нековалентни взаимодействия. В допълнение, на нивото на СН2 областта, молекулата е гликозилирана.

С развитието на молекулярно-генетичните технологии мини-антителата станаха широко разпространени: Fab- (фрагмент антиген свързващ) и scFv- (едноверижен фрагмент с променлива) фрагменти, които са способни специфично да свързват антиген, но имат по-голяма проникваща способност от пълноразмерните антитела. Fab фрагментът е 50 kDa протеин, състоящ се от регион на тежка верига (VH и CH1) и лека верига, свързани заедно чрез дисулфидни връзки и нековалентни взаимодействия. Фрагмент, състоящ се само от променливи региони (VH и VL), свързани с пептиден линкер, е scFv фрагмент и има молекулно тегло от 15 kDa. Рекомбинантните мини-антитела могат да бъдат произведени в бактериална експресионна система, за разлика от имуноглобулините с пълна дължина, чийто Fc домен е гликозилиран и, съответно, изисква системи за пост-транслационна модификация. Структурата и, съответно, физикохимичните свойства на фрагментите на антитялото са лесни за манипулиране на генно ниво и те могат да бъдат превърнати в антитела с пълна дължина, за да придобият ефекторни функции.

Главна част. Основната цел беше да се получат Fab фрагменти с висок афинитет на антитела срещу стероидния хормон кортизол.

Моноклоналните антитела, произведени от 5G-H2 хибридоми (получени в лабораторията по химия на протеиновите хормони на Института по биоорганична химия на Националната академия на науките на Беларус), са способни да се свързват специфично със стероидния хормон кортизол. Въпреки това, използването на хибридомни линии, продуциращи моноклонални антитела, има редица значителни недостатъци, които включват нестабилността на клетъчните линии, високата цена на култивирането и невъзможността за извършване на генно инженерни манипулации с имуноглобулинови гени. В допълнение, получени

Използвайки хибридомна технология, антителата могат да съдържат примеси от миши имуноглобулини, които увеличават вероятността от фалшиви резултати, когато се използват в диагностични системи. Всички тези ограничения могат да бъдат преодолени чрез използване на рекомбинантни антитела, получени с помощта на методи на генно инженерство и експресирани в бактериална система.

Първата стъпка беше изолирането на обща РНК от 5G-H2 хибридоми, които произвеждат специфични антитела към стероидния хормон кортизол. Общата РНК се изолира с помощта на комплекта за изолиране на обща РНК SV (Promega) и се използва незабавно за извършване на реакция на обратна транскрипция с олиго-IgT)18 праймери за получаване на сДНК (комплектът реагент Reverta-L от Централния изследователски институт по епидемиология на Роспотребнадзор беше използван).

Получената кДНК се използва като шаблон за амплификация на гени, кодиращи структурите на тежките и леките вериги на имуноглобулините. Въз основа на анализ на литературни данни и нуклеотидни последователности на имуноглобулини от базата данни на IMGT.org, бяха проектирани специфични дегенеративни праймери, за да покрият цялото разнообразие от cDNA гени, кодиращи леките и тежките вериги на миши имуноглобулини G клас. Амплификацията се извършва в усилвател BioRad T100 при следните условия: денатурация 94°С за 4 минути; 30 цикъла - денатурация 94°C за 1 min, отгряване 55°C за 1 min, елонгация 72°C за 1 min. Крайният етап на удължаване е -72°C за 10 минути.

Амплифицираните фрагменти се разделят чрез гел електрофореза в 2% агарозен гел, като се използва TAE буфер в присъствието на етидиев бромид (резултатите се записват с помощта на видео система Gel Imager 2 (Vilber Lourmat)). Във всеки случай бяха извършени положителни и отрицателни контроли на амплификация.

След PCR продуктите на амплифициране бяха клонирани във вектора pXcmkn12 и секвенирани, за да се потвърди правилната последователност на клонираната ДНК (нуклеотидната последователност беше определена с помощта на ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Ready Reaction Cycler Sequencing Kit, Big Dye X Terminator Purification Kit и секвенсер на Applied Biosystems 3130). Секвенирането показа, че клонираната тежка верига е от тип G2a, което е в съответствие с изотипа на антителата, произведени от хибридома, а леката верига е от тип k.

За експресиране на Fab фрагменти от антитела, специално проектиран

плазмиден вектор pCW-Fab, осигуряващ високо ниво на експресия на рекомбинантни антитела в периплазменото пространство на Escherichia coli.

За препаративна експресия бяха използвани Е. coli DH5a клетки, трансформирани с бицистронния вектор pCW-Fab, съдържащ клонирани гени на Fab домен.

Култивирането на Е. coli DH5a клетки се провежда в TB среда. Индукцията на клетъчната култура до протеинов синтез се извършва с помощта на IPTG (изопропил^^-1-тиогалакто-пиранозид), който предизвиква транскрипция чрез индукция на лактозния оперон.

Клетките бяха унищожени с помощта на хомогенизатор Emulsiflex-C5 с добавяне на детергент (CHAPS), инхибитор на серин протеаза (PMSF) и ß-меркаптоетанол. Унищожените клетки се отделят чрез центрофугиране. Супернатантът се нанася върху хроматографска колона с ProteinA Sepharose. ProteinA е протеин, експресиран в клетките на Staphylococcus aureus и способен на афинитетно свързване с CH1 домейна на тежката верига от имуноглобулини. Това позволява използването на афинитетна хроматография за изолиране на рекомбинантни Fab фрагменти (изолирането на протеин Bio-Rad „Bio-Logic“ и е използвана система за пречистване).

Хомогенността на получения протеин беше проследена с PAGE електрофореза при денатуриращи условия, която показа наличието на две полипептидни вериги с очакваното молекулно тегло, което потвърждава ефективността на създадените конструкции. Функционалната активност на рекомбинантни Fab фрагменти на антитела изисква допълнително проучване.

Заключение. Извършено е молекулярно клониране на гени, кодиращи структурата на миши имуноглобулини, специфични за кортизола. Резултатите от секвенирането потвърдиха, че клонираните фрагменти принадлежат към класа имуноглобулини. Създадените молекулярно-генетични конструкции направиха възможно осъществяването на хетероложна експресия на рекомбинантни Fab фрагменти в клетки на Е. coli. Получава се рекомбинантен протеин в хомогенно състояние с молекулно тегло, което отговаря на очакванията. Свойствата на получените Fab фрагменти на антитяло изискват допълнително проучване.

Авторският екип изказва благодарност на Лабораторията по химия на протеиновите хормони и лично на доктора на химическите науки О. В. Свиридов и кандидата на химическите науки Ивашкевич И. Г. за любезното предоставяне на 5G-H2 хибридомни клетъчни линии.

Литература

1. Spironelli, C. Плазмени нива на кортизол и ACTH при убийства на майки и насилствени психиатрични жени / C. Spironelli, F. J. Gradante // Psychiatr Res. - 2013. - кн. 47. - С. 622-627.

2. Иванов, В. Т. Протеини на имунната система. учебник помощ / В. Т. Иванов; Институт по биоорганична химия на името на. М. М. Шемякина. -M .: IBKhRAN, 1997. - 114 с.

3. Buchner, J. Ренатурация, пречистване и характеризиране на рекомбинантни Fab-фрагменти, произведени в Escherichia coli / J. Buchner, R. Rudolph // Biotechnology (NY). - 1991. - кн. 9 (2). -С.157-162.

4. Ahmad, Z. A. scFv антитяло: Принципи и клинично приложение / Z. A. Ahmad, S. K. Yeap, M. Hamid // Клинична и имунология на развитието. - 2012. - кн. 2012. - С. 3-17.

5. Димитров, Д. С. Терапевтичните антитела: текущо състояние и бъдещи тенденции – скоро ли ще се промени парадигмата? / Д. С. Димитров, Дж. Д. Маркс // Методи в молекулярната биология. - 2009. - кн. 525. -P. 1-27

6. Jez, J. Значително въздействие на единични N-Gly-can остатъци върху биологичната активност на Fc-базирани антитяло-подобни фрагменти / J. Jez, A. Castilho, H. Steinkellner // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - кн. 29. - С. 24313-24319.

7. Strebe, N. Клониране на променливи домейни от миши хибридом чрез PCR / N. Strebe, D. Moosmayer, S. Dubel // Antibody Engineering. -2010 г. - том. 1. - С. 3-14.

8. Rohatgi, S. Систематичен дизайн и тестване на вложени (RT-)PCR праймери за специфична амплификация на миши пренаредени/експресирани имуноглобулинови вариабилни гени от малък брой В-клетки / S. Rohatgi, P. Ganju, D. Sehgal // Вестник за имунологични методи. - 2008. -Кн. 330. - С. 205-219.